Signaling Signature in Situ

从核酸到蛋白，从序列到功能，一切的生命现象都可以归纳到这个过程中去。所以，我们对生命现象的探索也自然而然的可以大体分为2个层次：1.从浩如烟海的基因组数据中找出基因和其它重要的遗传元件，在序列水平上解读生命遗传信息的第一手资料。2.研究基因在生物体中是如果被激活，被表达，被调用的，从而建立起从静态的序列信息到动态的生物功能的桥梁。对于第一个层次的研究，过去半个世纪分子生物学经典研究的积累和当今高通量测序技术突飞猛进的发展和进步已经让我们走上了快车道；而对于第二个层次的研究，我们仍然是刚刚起步。诚然，在过去的一二十年中，我们对这方面的研究已经投入了很大努力，曾经火热的生物芯片和分子信号转导的研究就是明证。但我觉得这里面存在一个很大的一个问题。过去由于研究手段的限制，我们基本上只能通过体外(in vitro)实验来研究基因的转录、表达和调控，然而生物的功能毕竟是要在体内(in vivo)环境中实现的,而体内和体外环境的差异（包括物化特性和生物特性）可能远超过我们的想象，这就导致了一个我们必须面对的问题：我们体外实验所得到的结果有多少是真正与生物体内的真实情况相符合的？在涉及到对复杂生物现象的研究时这个问题尤其需要考虑。

在这样的背景下，怎样将相对成熟的体外实验通过一定得方法在体内重现一直是当前生物学研究中令人瞩目的领域，比如我曾经写过的利用DSLM跟踪脊椎动物如斑马鱼的胚胎发育过程，再比如今天我要介绍的通过FRET在全胚胎水平对影响生物发育的一个关键蛋白Cdc42的体内激活模式的实时跟踪研究，这个成果发表在这周的Science上(2008 Jun 5)。

首先介绍下FRET技术吧，FRET(Forster Resonance Eenergy Transfer)即荧光共振能量转移，是指当两个荧光发色基团在足够靠近时，受外界环境（如紫外光）激发的供体分子通过偶极－偶极耦合作用向邻近的受体分子转移能量的过程。尤其是结合绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发明，这项技术被广泛应用于生命科学研究中，以实现对细胞内蛋白-蛋白间的相互作用进行定时、定位、定量的无损伤检测。但在以前的研究中，该技术还是基本被用于对活细胞的体外实验，而我们今天介绍的这篇文章的意义就在与突破性的实现了该项技术在活体生物组织和胚胎水平研究中的运用。为了达到这个目的，作者利用了他们的目的分子Cdc42在体内被激活时会与CBD（Cdc42-binding domain）相互结合的特性并结合FRET的原理巧妙设计了两种生物探针。



如图1所示，A为单分子探针，Cdc42与CBD以及各自所带的荧光蛋白被设计在同一条多肽链上。一旦Cdc42在体内被激活，则它与CBD会互相结合，而二者距离上的接近则为各自所带的荧光蛋白间的共振能量转移创造了条件。通过体外的紫外照射监控，Cdc42所带的蓝色荧光蛋白(CFP)会一直处在激发状态，所以Cdc未被激活时，整个体系释放蓝色荧光信号。而一旦Cdc被激活，随着其与CBD的结合，由于CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有很大重叠，CFP上的能量会被传递到与CBD紧密相连的黄色荧光蛋白（YFP）并使其处在激发态，从而整个体系释放黄色荧光信号。而通过对这种荧光信号变化的实时记录，就可以了解体内Cdc42蛋白被激活的准确时间和方位。此外，该体系还有另外一个优点，由于Cdc42与CBD在探针上以严格的1：1比例存在，所以通过检测荧光信号强度，还可以准确计算出Cdc42分子被激活的强度。而与之对应的B为双分子探针，Cdc42与CBD分别连同各自的荧光蛋白分别被设计在两条多肽链上。其作用原理与单分子探针一样，不过无法准确定量Cdc42蛋白被激活的强度，但它也有优势，它的探针更小，可以最大限度的降低人为因素对生物体系的影响。在这篇文章中，作者一方面使用性能更为突出的单分子探针分别从细胞、组织和整个胚胎水平实时记录了果蝇体内Cdc42激活模式和强度，另一方面同时使用更可靠的双分子探针做了Control，以确保结果的可靠性。



图2便是果蝇整个胚胎(A)、气管(B)以及中枢神经系统(C)在不同时间点上Cdc42蛋白被激活的模式和强度图，蓝色代表未被激活，黄色和红色代表被激活。这样的实时精确记录可以为我们进一步了解该蛋白在果蝇整个发育过程中的信号转导模式和所涉及的功能做更深入的研究，从而最终实现从序列到功能的跨越。

不难想象，同样的技术可以推广到对其他重要蛋白的功能和调控网络研究上去，从而大大丰富和加深我们现有的对于基因功能的认识。其实，抛开科学意义不说，仅仅想想如此复杂的生命过程以如此美丽和生动的方式展现在我们的眼前就足以让我们激动不已了，我想这就是生命科学研究的美妙之处吧！：）

参考文献

1.Kamiyama D, Chiba A.(2009) Endogenous Activation Patterns of Cdc42 GTPase Within Drosophila Embryos.Science 324: 1338 - 1340.
2.Nalbant P, Hodgson L, Kraynov V, Toutchkine A, Hahn KM.(2004) Activation of endogenous Cdc42 visualized in living cells.Science 305: 1015 - 1019.