Saturday, June 06, 2009
Signaling Signature in Situ
在这样的背景下,怎样将相对成熟的体外实验通过一定得方法在体内重现一直是当前生物学研究中令人瞩目的领域,比如我曾经写过的利用DSLM跟踪脊椎动物如斑马鱼的胚胎发育过程,再比如今天我要介绍的通过FRET在全胚胎水平对影响生物发育的一个关键蛋白Cdc42的体内激活模式的实时跟踪研究,这个成果发表在这周的Science上(2008 Jun 5)。
首先介绍下FRET技术吧,FRET(Forster Resonance Eenergy Transfer)即荧光共振能量转移,是指当两个荧光发色基团在足够靠近时,受外界环境(如紫外光)激发的供体分子通过偶极-偶极耦合作用向邻近的受体分子转移能量的过程。尤其是结合绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的发明,这项技术被广泛应用于生命科学研究中,以实现对细胞内蛋白-蛋白间的相互作用进行定时、定位、定量的无损伤检测。但在以前的研究中,该技术还是基本被用于对活细胞的体外实验,而我们今天介绍的这篇文章的意义就在与突破性的实现了该项技术在活体生物组织和胚胎水平研究中的运用。为了达到这个目的,作者利用了他们的目的分子Cdc42在体内被激活时会与CBD(Cdc42-binding domain)相互结合的特性并结合FRET的原理巧妙设计了两种生物探针。
如图1所示,A为单分子探针,Cdc42与CBD以及各自所带的荧光蛋白被设计在同一条多肽链上。一旦Cdc42在体内被激活,则它与CBD会互相结合,而二者距离上的接近则为各自所带的荧光蛋白间的共振能量转移创造了条件。通过体外的紫外照射监控,Cdc42所带的蓝色荧光蛋白(CFP)会一直处在激发状态,所以Cdc未被激活时,整个体系释放蓝色荧光信号。而一旦Cdc被激活,随着其与CBD的结合,由于CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有很大重叠,CFP上的能量会被传递到与CBD紧密相连的黄色荧光蛋白(YFP)并使其处在激发态,从而整个体系释放黄色荧光信号。而通过对这种荧光信号变化的实时记录,就可以了解体内Cdc42蛋白被激活的准确时间和方位。此外,该体系还有另外一个优点,由于Cdc42与CBD在探针上以严格的1:1比例存在,所以通过检测荧光信号强度,还可以准确计算出Cdc42分子被激活的强度。而与之对应的B为双分子探针,Cdc42与CBD分别连同各自的荧光蛋白分别被设计在两条多肽链上。其作用原理与单分子探针一样,不过无法准确定量Cdc42蛋白被激活的强度,但它也有优势,它的探针更小,可以最大限度的降低人为因素对生物体系的影响。在这篇文章中,作者一方面使用性能更为突出的单分子探针分别从细胞、组织和整个胚胎水平实时记录了果蝇体内Cdc42激活模式和强度,另一方面同时使用更可靠的双分子探针做了Control,以确保结果的可靠性。
图2便是果蝇整个胚胎(A)、气管(B)以及中枢神经系统(C)在不同时间点上Cdc42蛋白被激活的模式和强度图,蓝色代表未被激活,黄色和红色代表被激活。这样的实时精确记录可以为我们进一步了解该蛋白在果蝇整个发育过程中的信号转导模式和所涉及的功能做更深入的研究,从而最终实现从序列到功能的跨越。
不难想象,同样的技术可以推广到对其他重要蛋白的功能和调控网络研究上去,从而大大丰富和加深我们现有的对于基因功能的认识。其实,抛开科学意义不说,仅仅想想如此复杂的生命过程以如此美丽和生动的方式展现在我们的眼前就足以让我们激动不已了,我想这就是生命科学研究的美妙之处吧!:)
参考文献
1.Kamiyama D, Chiba A.(2009) Endogenous Activation Patterns of Cdc42 GTPase Within Drosophila Embryos.Science 324: 1338 - 1340.
2.Nalbant P, Hodgson L, Kraynov V, Toutchkine A, Hahn KM.(2004) Activation of endogenous Cdc42 visualized in living cells.Science 305: 1015 - 1019.
Sunday, February 22, 2009
Hide-and-Seek with Nature
我的Blog 09年2月份好像还没更新过,原因有二,2月上半月,一个字,懒,在家待得乐不思科研,呵呵;2月下半月,还是一个字,忙,在实验室忙着做数据,连看文献的时间都没了,更别提写Blog了。这不行啊,咱承诺过,至少每月一篇吧,但又连翘几期N&S了,肚子里没货啊。那咋办呢?就随便谈谈科研感想吧,虽有灌水之嫌,但也是真情实感不是?:)
Hide-and-Seek with Nature(与自然捉迷藏),恩,这个标题不错,先自我欣赏下,嘿嘿,以后大牛了写自传就用这标题,哈哈哈
现在的课题由年前的课题结果衍生而来,两个课题间过渡的逻辑再自然不过了。量变与质变,连续与飞跃,渐变与爆发,这委实就是自然界的通用秩序。怎么看,怎么自然,简直大自然,哈哈:)
可是呢,经过年后十来天的努力,随着研究的深入发现事情似乎没有那么简单。我们所设想的那种完美的秩序在这里似乎有些被动摇了,打散了。一度明晰的自然之律在这一刻由又重新变得越来越混沌,我也变得越来越迷茫,搞不清,搞不清啊。
科学的发现过程大抵都如此吧。证据-》假说-》实验验证-》结果不符-》修改假说-》继续验证...如此循环往复,步步逼近...
这不就是和自然捉迷藏嘛?咱这个概括还算准确吧?还算生动吧?而且富有童心吧?:P
今天实在被负面的数据结果搞得有些郁闷了,所以扯了这么多。不过想想也正常,咱的对手是自然啊,小爱同学都奉为God了,那玩起捉迷藏起来还能容易啊?
所以呢,今天晚上就看看球,堕落下。明天早起,舒活舒活筋骨,抖擞抖擞精神,继续和自然捉迷藏哈:P
Friday, January 09, 2009
Next-generation Sequencing Technique
最近几年,一些第二代测序方法相继取得突破。2005年,先行者454测序技术(现在已被Roche收购并推向市场)完成了对Mycoplasma genitalium全基因组的测定,这是世界上第一个由非Sanger法完成的全基因组测序。从这一刻开始,Illumina公司的Solexa技术,ABI公司的SOLiD技术,基于开源平台的Polonator技术,还有以单分子测序为目标的HeliScope和Pacificbiosciences公司的实时测序(Real-time Sequencing)技术相继映入我们的眼帘,看得我们眼花缭乱。下面,我就分别对传统的Sanger法以及第二代测序技术中的几个代表Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD,并且着重介绍个人觉得最华丽的Pacificbiosciences 实时测序技术。:P
传统测序方法
Sanger双脱氧法
如图1所示,a)首先将待测基因组序列打断成较短的DNA片段,以方便后面的处理。b)将所得的DNA片段连入质粒载体在E.coli体内扩增,使DNA片段得到富集。挑取单菌落分离纯化出其中的质粒用去测序。c)在反应体系中加入DNA聚合酶,dNTP以及带有荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP。由于ddNTP的链终止作用,使得对于每个片段的DNA模板,会扩增出一系列长短不一且3'端带有荧光标记ddNTP的核苷酸片段。当扩增出来的这种片段足够多的时候对于模板的每一个核苷酸位点都有相应的荧光标记3’端ddNTP与之对应。d)这样,我们通过毛细管凝胶电泳来分析这一系列标记过的核苷酸片段,收集每个位点上的荧光信号,通过软件处理,就可以得到高质量的DNA序列信息。我们前面说过,现在的Sanger测序仪采用96个毛细电泳管的阵列,可以同时进行96个这样的测序反应,每个反应得到的Read长度可以达到1000bp以上。
第二代测序方法
Roche 454 法
Illumina Solexa法
如图3所示,a)将待测基因组序列打断成较短的DNA片段,片段两端分别连接特定接头,并使双链熔解拆分为单链DNA分子。b) 通过接头将单链DNA分子随机吸附在反应板表面,然后利用桥式 PCR(bridge PCR)扩增每个单链DNA分子拷贝数。通过这一步,同种单链DNA将成簇分布在反应板表面。c)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记(分别针对dATP,dTDP,dGDP,dCDP)和可变粘性3'端的dNTP。对任何一条模板序列,它在聚合1bp的核苷酸后由于聚合上去的dNTP粘性末端被封闭,将无法再聚合第二个核苷酸。此时,用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。加入试剂去除被聚合上去的dNTP的荧光基团,然后恢复3'端粘性,继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去,直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,联合统计每轮收集到的荧光信号结果,就可以得知每个模板DNA片段的序列。这种方法一次可以同时完成3000~6000万个反应,但每个反应的Read长度暂时只能达到30bp左右。
ABI SOLiD法
如图4所示,a)将待测基因组序列打断成较短的DNA片段,片段两端分别连接特定接头,并使双链熔解拆分为单链DNA分子。b) 利用直径为1µm的DNA吸附珠与单链DNA分子特定端接头的吸附作用吸附固定单链DNA分子(控制条件使每一个珠子仅吸附一条DNA单链分子),然后利用乳化PCR(emulsion-based PCR , emPCR)扩增每个珠子上的DNA分子拷贝数,以备下一步测序使用。将珠子随机吸附在反应平板上。c)采用一系列用荧光标记的寡核苷酸(8个核苷酸)探针,探针3'端的前2个核苷酸为测序反应提供信息。ABI SOLiD法与以上几种方法显著不同的是它使用DNA连接酶而非聚合酶进行测序反应。通过连接反应,不同的寡核苷酸探针与模板序列竞争结合,只有3’端前两个核苷酸与模板链相应位置完全配对互补的探针才会被连接到模板的互补链上,这样,通过多轮反应,模板链上位置编号为(1 or 2 +8N)的核苷酸位点的序列将被测定。然后将模板互补链的引物接头延长一个核苷酸,同样的采用连接酶进行多轮测序,则模板链上位置编号为(2 or 3 +8N)的核苷酸位点的序列将被测定,如此反复几次,就可以获得模板DNA分子的全长序列信息。由于采用了更小的吸附珠子,这种方法比Roche 454法拥有更高的通量,但每个反应的Read长度暂时只能达到35bp左右。
Pacificbiosciences 实时测序技术
上面介绍了这么多种测序方法,到底那种最好呢?这个问题现在还不好回答。Roche 454商业化的最早,每Read的测序长度也比较长,但其通量仍有限,且测序成本现在还很高。Illumina Solexa和ABI SOLiD的测序通量很高,测序成本也较低,但每Read的长度太短,全基因组测序的话会有困难,除非有好的参考序列(reference)。我个人最看好的Pacificbiosciences 实时测序技术现在还没有完全成熟和商业化,因此还有许多未知数。 2008年7月,Archon X Prize Foundation宣布,如果哪个研究组使用第二代测序技术能在10天内实现对100个人的基因组完全测序,且每个基因组测序成本不高于10,000美元,他们将获得10,000,000美元的奖金。究竟那种技术会最终胜出,我们拭目以待。:P
参考文献
- M. Margulies, et al. (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376–380
- D. Wheeler, et al. (2008) The complete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing. Nature 452: 872–877
- J.M. Rothberg, J.H. Leamon (2008) The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology 26: 1117-1124
- J. Shendure, H. Ji (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology 26: 1135-1145
- A. Boodhun, et al (2008) Accurate whole human genomesequencing using reversible terminatorchemistry. Nature 456: 53-59
- J. Eid, et al (2009) Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science 323: 133-138